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本篇分享人骨骼肌细胞培养的方法不要错过了
发布时间:2022-11-25   点击次数:203次
  有丝分裂。称作卫星细胞的肌原细胞,相互融合在一起,形成多核的肌管细胞(myotubue cell)。随着肌管细胞内肌原纤维的数量增加,肌管细胞成为骨骼肌细胞。成熟的骨骼肌细胞是一种有丝分裂后细胞,不能进行有丝分裂。
 
  所以,虽然通过C6H15O12P3消化可进行传代3~4次,但如果发生分化,融合形成肌管,则很难再传代下去。同样,一旦细胞开始融合,细胞增殖也很难评估。
 
  以下所述为肌肉活检组织酶消化法。来自健康人活检的初代培养材料,富含肌原细胞,初代培养在Ham12补加20%胎牛血清培养条件下,很易生长。
 
  但原代骨骼肌细胞培养的难点就在于它的纯化,因为成肌细胞和成纤维细胞混杂生长很难区分。在常规培养条件下,这些细胞能够增殖和分化融合形成多核细胞的肌管,证明培养的细胞有成肌性。
 
  人骨骼肌细胞培养方法如下:
 
  【材料】
 
  1.组织来源健康人肌肉活检组织。
 
  2.培养用试剂
 
  (1)培养液Ham F12。
 
  (2)PBS。
 
  (3)(Pronase)液:0.15%和0.03% EDTA,带有20U/ml和20 ug/ml的(0.4% Eurobio PES3000),溶在100ml Ham F12或PBS中。
 
  3.培养基配方和制备Ham F12加20%胎牛血清。
 
  4.实验器材100um过滤网、手术刀、眼科剪、眼科镊、培养皿(切割用)、培养瓶、血细胞计数器和离心管。
 
  【方法】
 
  1.取材用剪刀剪除活检组织的非肌组织,用PBS抗生素缓冲液冲洗3次。按与肌肉纤维平行方向切割成小块,在称量之前用PBS冲洗3次。把组织小块摆放在平皿上,切成lmm3大小的碎块,不要挤压造成伤害,用PBS冲洗3次,弃掉上清。
 
  2.消化在37℃液中消化1小时(1~3mg组织需要15 ml消化液),每3~5分钟摇晃或吸管吹打使细胞分离。用吸管吹打消化物,使更多的细胞分散下来,培养液应变得越来越浑浊。加入含20%胎牛血清的生长培养基终止消化,让组织块慢慢沉到管底。
 
  3.分离细胞集合所得上清液,用100um过滤网滤过入20ml离心管中,进行800r/min离心8~10分钟,吸出上清液弃掉。加10ml生长培养液重悬沉积物,用吸管轻轻吹打,然后用计数器计数细胞。
 
  4.接种与培养用生长培养基稀释悬液,接种入培养瓶中,细胞密度1.5x104个/ml。把培养瓶置入37℃,5% CO2细胞培养箱中培养。
 
  【结果】
 
  体外培养的骨骼肌细胞,经显微镜鉴定,刚分离出的原代细胞比较小,呈球形,折光性强。12小时后,细胞开始贴壁,72小时后贴壁,贴壁后绝大多数逐渐延展成为梭形,少数有突起,为不规则状,换液可在培养3天后进行,随着培养时间的延长,细胞增殖、迁移并逐渐规律性地沿一个方向排列。
 
  一旦细胞长满整个培养瓶,产生接触抑制,增殖将明显受到抑制,表现为相邻细胞相互融合,形成肌小管,即表现出分化倾向。
 
  初始形成的肌小管的多个细胞核沿细胞中心排列,形成中心核链,而合成的少量肌原纤维则位于周边。随着分化的继续,肌原纤维大量生成,逐渐占据细胞中的部位,迫使中心核链的核移向周边,即形成幼稚肌纤维。另外还可以用组织块法培养,约1周可见组织块周围有梭形的细胞爬出,但只是部分组织块周围有细胞。
 
  透射电镜下观察,分裂增殖早期的骨骼肌细胞核含核仁1~3个,细胞质中有不规则分布的束状平行排列的肌丝,部分区域肌丝尚未形成,并有少量幼稚线粒体。
 
  早期细胞内有长梭形高电子密度结构,呈散在分布;晚期细胞胞质肌丝更丰实,但无明显肌节形成,可见分化较成熟的线粒体、糖原和游离核糖体聚集于肌束周边,使丰实的肌丝呈束状平行排列。
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